細胞培養(yǎng)技術也叫細胞克隆技術,在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術。不論對于整個生物工程技術,還是其中之一的生物克隆技術來說,細胞培養(yǎng)都是一個不可少的過程,細胞培養(yǎng)本身就是細胞的大規(guī)模克隆。細胞培養(yǎng),既包括微生物細胞的培養(yǎng),也包擴細胞培養(yǎng)技術可以由一個細胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞,這是克隆技術不可少的環(huán)節(jié),而且細胞培養(yǎng)本身就是細胞的克隆。通過細胞培養(yǎng)得到大量的細胞或其代謝產(chǎn)物。因為生物產(chǎn)品都是從細胞得來,所以可以說細胞培養(yǎng)技術是生物技術中最核心、最基礎的技術。
細胞培養(yǎng)操作過程:
注意無菌。無論哪一管液體,開蓋后盡量立即關上(如果有幾瓶都需要開的,也注意,可以虛蓋)。蓋子向上放。操作時不要從開蓋的容器上方經(jīng)過。另外,無菌臺面上擺放的各種東西,最好是一字擺開,平行于自己。盡量不要前后重疊。
細胞操作中所用的所有耗材試劑最好都是細胞培養(yǎng)專用。一般都以一次性耗材居多。1ML槍頭為加長型專用培養(yǎng)槍頭。移液管亦有專用10mL一次性無菌移液管
?。?)細胞換液:
培養(yǎng)皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養(yǎng)液,加入新培養(yǎng)液。
?。?)細胞傳代:
傳代之前先觀察,細胞是否密集,是否開始融合。一般融合達到70-80%就可以傳代。早點傳代也可以。
如果是貼壁生長的細胞:
1) 培養(yǎng)皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養(yǎng)液;
2) 無菌PBS或無菌生理鹽水洗滌3次(按培養(yǎng)體積加入);
3) 加入適量胰酶消化適當時間(一般胰酶為0.25%;9cm/10cm培養(yǎng)皿和25cm培養(yǎng)瓶,一次加入1mL胰酶。消化時間視細胞類型等多種情況綜合考慮,一般如果是細胞株,非原代培養(yǎng),消化1-2分鐘足矣);
4) 用槍頭吹打數(shù)十次(視細胞類型而定。一般細胞株30-50次吧,耗時一般2分鐘左右);
5) 加入適量體積*培養(yǎng)基終止胰酶消化(如果是9cm/10cm培養(yǎng)皿和25cm培養(yǎng)瓶,可以加入1mL*培養(yǎng)基;現(xiàn)在培養(yǎng)瓶(皿)里有2mL溶液)。
6) 現(xiàn)在可以將溶液進行分瓶(2mL)。如果是細胞株,直接均分到兩個培養(yǎng)瓶(皿)里。如果是原代培養(yǎng),可以根據(jù)消化時間來對細胞進行分離;因此可以將溶液(2mL)都轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶(皿)。
7) 將兩個培養(yǎng)瓶(皿)補足*培養(yǎng)基到正常體積(果是9cm/10cm培養(yǎng)皿和25cm培養(yǎng)瓶,為5mL*培養(yǎng)液)
8) 鏡下觀察。剛剛傳代細胞還沒貼壁,懸浮在溶液中,呈圓形。一般2h之內(nèi)會貼壁,如果已經(jīng)貼壁,根據(jù)細胞類型有不同的形態(tài),但通常都不是圓形。
9) 鏡下觀察無誤之后,再放入細胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)瓶(皿)放入之前,可以用消毒酒精先擦一下。
10) 傳代之后,最好第二天細胞換液一次。當然,也可以視情況而定。